Developmental Biology • Plant Research

Research report (imported) 2006 - Max Planck Institute for Plant Breeding Research

Eine neue Funktion für Glutaredoxine in der Blütenentwicklung

A novel function for glutaredoxins in flower development

Authors

Zachgo, Sabine

Departments

Molekulare Pflanzengenetik (Prof. Dr. Heinz Saedler)
MPI für Pflanzenzüchtungsforschung, Köln

Die Arabidopsis Mutante roxy1 bildet eine reduzierte Anzahl von Petalen, die im Differenzierungsverlauf dann noch weitere Defekte zeigen. Molekulare Analysen zeigten, dass das ROXY1 Gen ein Glutaredoxin (GRX) kodiert. GRX sind kleine, weit verbreitete Oxidoreduktasen, die in E. coli, Hefe und dem Menschen intensiv untersucht wurden und die Cysteine in konservierten Motiven reduzieren und oxidieren können. GRX sind in unterschiedliche Prozesse involviert und üben insbesondere bei der Abwehr von oxidativem Stress eine wichtige Funktion aus. Die Untersuchung von ROXY1 zeigte erstmalig, dass pflanzliche GRX an der Blütenentwicklung beteiligt sind. ROXY1 verändert wahrscheinlich Proteine, die für eine normale Petalen-Organogenese notwendig sind. Überraschenderweise gehört ROXY1 zu einer neuen Unterklasse der GRX, dem CC-Typ, der ausschließlich in Landpflanzen vorkommt. Das Vorhandensein einer großen Anzahl von CC-Typ GRX in Angiospermen (Bedecktsamern) deutet darauf hin, dass ihre Fähigkeit, Proteine zu verändern, in Prozesse integriert wurde, die dazu beigetragen haben, dass sich die komplexen Blüten der höheren Landpflanzen entwickelten. Die weitere Analyse von ROXY1 und anderen Mitgliedern der CC-Typ-Gruppe zielt darauf ab, mehr über ihre Zielgene zu erfahren und darüber Aufschluss zu bekommen, ob und wie Redoxregulierung und Blütenentwicklung miteinander verknüpft sind.
The roxy1 mutant from Arabidopsis thaliana initiates a reduced number of petal primordia and exhibits abnormalities during further petal development. The defects are restricted to the second whorl of the flower and independent of the organ identity. ROXY1 is predominantly expressed in tissues that give rise to new flower organs, including petal precursor cells and petal primordia. Glutaredoxins (GRXs) are small, ubiquitous oxidoreductases that have been intensively studied in E. coli, yeast and humans and oxidize or reduce conserved, cysteine containing motifs. They are involved in a large variety of cellular processes and exert a crucial function in the response to oxidative stress. Our data demonstrate that, unexpectedly, a plant glutaredoxin is involved in flower development, likely by mediating posttranslational modifications and thus affecting the activity of target proteins required for normal petal organ initiation and morphogenesis. Surprisingly, ROXY1 belongs to a novel subgroup, the CC-type, being specific for land plants. The existence of large CC-type subfamilies in angiosperms supports the assumption that their capability to posttranslationally modify target protein activity has been integrated into crucial plant specific processes coinciding with the development of complex flowers. Further analysis of ROXY1 and other CC-type members aims for an understanding of their biochemical properties, the identification of target proteins and unraveling the intriguing connection between redox regulation and flower development.

Die Blüte höherer Pflanzen stellt ein ausgezeichnetes Modellsystem dar, um Prozesse der Musterbildung zu untersuchen. Die Perzeption einer Veränderung endogener und exogener Faktoren durch die Pflanze führt dazu, dass die vegetative durch die generative Wachstumsphase abgelöst wird und dass anstatt von Blättern und Stängeln nun Blüten ausgebildet werden.

Trotz der zahlreichen Variationen in der Blütenmorphologie zwischen verschiedenen Pflanzenarten lässt sich ein gemeinsamer Bauplan in der Anordnung der Blütenorgane erkennen. Die meisten Blüten der Angiospermen sind aus vier konzentrisch angeordneten Wirteln zusammengesetzt: im ersten Wirtel werden die Sepalen (Kelchblätter) gebildet, im zweiten Wirtel die Petalen (Blütenblätter). Die Stamen (Staubblätter) entwickeln sich im dritten und die Karpelle (Fruchtblätter) im vierten Wirtel. Genetische und molekulare Analysen der homöotischen Blütenmutanten von Antirrhinum und Arabidopsis haben gezeigt, dass MADS-Box-Transkriptionsfaktoren die Identität der Blütenorgane kontrollieren. Jedoch ist noch unklar, wie in dem regulatorischen Netzwerk oberhalb der Hierarchieebene, die von den MADS-Box-Genen kontrolliert wird, die Anzahl der Blütenorganprimordien und deren Position im Blütenmeristem gesteuert wird.

ROXY1: Ein Glutaredoxin mit einer neuen Funktion in der Blütenentwicklung

Um die molekularen Mechanismen, die diesen Prozess steuern, genauer zu untersuchen, wurde in der Arabidopsis T-DNA Insertions-Kollektion von GABI-KAT eine T-DNA-Mutante mit einer anormalen Petalenentwicklung identifiziert und charakterisiert (Abb. 1). Die T-DNA -nsertion liegt in einem Gen, das für ein Glutaredoxin (GRX), eine Oxidoreduktase, kodiert. Die Analyse dieses Gens, das ROXY1 genannt wurde, zeigte erstmalig, dass ein pflanzliches GRX eine Funktion während der Blütenentwicklung ausübt.

Die Petalenanzahl und Petalenentwicklung von roxy1 (rechts) ist im Vergleich zur Arabidopsis Wildtyp-Blüte (links) verändert. Bild vergrößern
Die Petalenanzahl und Petalenentwicklung von roxy1 (rechts) ist im Vergleich zur Arabidopsis Wildtyp-Blüte (links) verändert. [weniger]

Blüten der roxy1 Mutante bilden durchschnittlich nur 2,5 statt 4 Petalen aus, deren Entwicklung oft verlangsamt und in der Organdifferenzierungsphase anormal verläuft (Abb. 1). Die Größe der Petalen ist häufig reduziert und die Lamina sind oft gefaltet, sodass die Petalen auch nach der Anthese der Blüte nicht immer aus den Sepalen im ersten Wirtel herausragen. Expressionsanalysen mittels in situ Hybridisierungen und transgener Promotor-Reportergen-Pflanzen zeigten, dass ROXY1 mRNA und Protein nicht nur in den Petalenprimordien vorhanden sind, sondern darüber hinaus auch im jungen Blütenmeristem und in den Primordien der Sepalen, Stamen und Ovulen exprimiert werden. Da diese Strukturen keine Abweichung vom Wildtyp in der roxy1 Mutante zeigen, deutet dies auf eine eventuell redundante Funktion hin: Weitere GRXs könnten dort ausgeprägt sein und die Funktion statt ROXY1 ausüben. Durch Kreuzungen mit anderen Blütenmutanten konnte gezeigt werden, dass die ROXY1-Funktion Wirtel- und nicht Organ-spezifisch ist. Auch wenn im zweiten Wirtel in Doppelmutanten Sepalen gebildet werden, ist deren Anzahl und Organogenese defekt. Weiterhin zeigten diese Untersuchungen, dass ROXY1 auch an der Regulation der Expressionsdomäne von AGAMOUS, einem MADS-Box-Gen, das die Ausbildung der reproduktiven Organe steuert, beteilig ist. Somit übt ROXY1 eine komplexe Funktion während der Blütenentwicklung aus, die über eine Beteiligung an der Initiierung der Petalen hinausreicht.

Funktionen der GRX

GRX sind kleine (~12 kDa), ubiquitär exprimierte Redoxproteine. Sie enthalten ein typisches Dithiol- (CXXC) oder Monothiol-Motiv (CXXS), das für die Reduktion von Disulfiden verantwortlich ist. Bislang wurden überwiegend GRX aus Bakterien, Hefen, Tieren und dem Menschen analysiert, wo sie eine wichtige Rolle bei der Regulation von oxidativem Stress spielen. GRX beeinflussen mittels posttranslationaler Modifikationen die Aktivität von Proteinen. Sie können entweder intra-und intermolekulare Protein-Disulfidbrücken oder auch glutathionylierte Proteine reduzieren und damit Proteinmodifikationen wieder aufheben. Interessant ist, dass die Glutathionylierung auch für Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise NF-kB und c-Jun, einen Mechanismus darstellt, mit dem die DNA-Bindung in Abhängigkeit vom Redoxstatus der Zelle reguliert werden kann. Es ist nur sehr wenig über glutathionylierte Proteine aus pflanzlichen Organismen bekannt. Kürzlich wurde ein Redox-sensitiver pflanzlicher Transkriptionsfaktor, TGA1, beschrieben, der in seiner reduzierten Form eine erhöhte DNA-Bindungskapazität aufweist. Diese Beispiele zeigen, dass auch ROXY1 wahrscheinlich mittels posttranslationaler Modifikationen die Aktivität von Proteinen verändert, die eine regulatorische Funktion in der Blütenentwicklung ausüben. Ob diese entwicklungsbiologische Funktion abhängig ist von einem veränderten Redoxpotenzial der Zellen, wie es bei der Stressantwort gezeigt wurde, ist eine interessante Frage, die in Zukunft untersucht werden wird.

ROXY1 gehört zu einer pflanzenspezifischen Subklasse der GRX

Aminosäure-Sequenzvergleiche von verschiedenen GRX haben gezeigt, dass photosynthetisch aktive Organismen eine zusätzliche Gruppe von GRX besitzen. Während GRX, die ein charakteristisches CPYC- und CGFS- Motiv besitzen, in allen untersuchten prokaryotischen und eukaryotischen Spezies vorkommen, wurde eine zusätzliche Gruppe, der CC-Typ, nur in Landpflanzen identifiziert (Abb. 2).

Aminosäure-Sequenzvergleiche von GRX verschiedener Landpflanzen zeigen, dass GRX drei Subklassen, den CGFS-, CPYC- und CC-Typ bilden. Bild vergrößern
Aminosäure-Sequenzvergleiche von GRX verschiedener Landpflanzen zeigen, dass GRX drei Subklassen, den CGFS-, CPYC- und CC-Typ bilden. [weniger]

Die Aminosäure-Identität der gesamten Proteine zwischen diesen drei CPYC-, CGFS- und CC-Typ- Klassen variiert zwischen 5 und 95%. Nur vier Aminosäuren sind in Arabidopsis allen GRX-Proteinen gemeinsam: das erste Cystein des aktiven Motivs sowie ein Prolin, Glycin und Leucin im C-terminalen Teil der GRX. ROXY1 gehört zum CC-Typ, welcher mit 21 GRX, die ein CCMC- oder CCMS-Motiv besitzen, die größte Klasse in Arabidopsis darstellt. Die große Anzahl an homologen CC-Typ GRX könnte eine Erklärung dafür sein, warum der roxy1 Phänotyp, trotz einer breiten ROXY1-Expression in verschiedenen Primordien und Organen, auf die Petalen beschränkt ist. Interessanterweise ist die Gruppe der CC-TYP GRX in niederen Landpflanzen wie dem Moos noch sehr klein und besteht aus nur zwei Vertretern (Abb. 3). Bei der Kiefer, einem Vertreter der Gymnospermen (Nacktsamern), finden sich fünf CC-Typ GRX und bei den Angiospermen stellen sie beispielsweise in Arabidopsis die größte Gruppe der GRX dar. Im Vergleich dazu bleibt die Anzahl der CPYC- und CGFS-Typ GRX in den untersuchten Landpflanzen relativ ähnlich.

Zusammensetzung der GRX aus den CPYC-, CGFS-und CC-Typ-Klassen in fünf evolutionär informativen Pflanzenspezies (Stand: Oktober 2005). Bild vergrößern
Zusammensetzung der GRX aus den CPYC-, CGFS-und CC-Typ-Klassen in fünf evolutionär informativen Pflanzenspezies (Stand: Oktober 2005). [weniger]

Was kann man aus diesen Analysen über die Funktion der GRX und ihre Evolution lernen? Zum einem zeigten sie, dass die CC-Typ GRX Funktionen ausüben könnten, die spezifisch für Landpflanzen sind. Weiterhin deutet die Expansion der CC-Typ GRX Subklasse in den Landpflanzen darauf hin, dass sich CC-Typ GRX an den im Laufe der Evolution immer komplexer werdenden Blütenstruktur-Bildungen beteiligen. Die Analyse von weiteren CC-Typ GRX wird es in Zukunft ermöglichen, auf diese Fragen eine Antwort zu finden.

 
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